Planta
Planta (1988) 174: 453-461
9 Springer-Errag 1988
Efeitos de temperatura no efluxo de ácidos malic dos vacúolos e nas vias de carboxilação em plantas crassulaceanas-áídicas-metabolismo *V. Friemert I, D. Heininger 2, M. Kluge 1 '** e H. Ziegler 2 1 Instituto Fiir BotanikDer Technischen Hochschule Darmstadt, Schnittspahnstrage 3, D-6100 Darmstadt e 2 Institut Ffir Botanik der Technischen Universit/It Miinchen, Arcisstrasse 21, D-8000 Miinchen, República Federal de Germania.Os estudos descritos no artigo foram conduzidos com fatias de tecido do metabolismo do ácido crassulaco (CAM), flutuando em tampão isotônico.Em uma primeira série de experimentos, foram estudados efeitos de temperatura no efluxo de [14C] malato e 14CO2.Um aumento da temperatura aumentou o efluxo do tecido de maneira não linear.O efluxo foi acentuadamente influenciado também pelas temperaturas aplicadas durante o pré -tratamento.As taxas de exportação de etiquetas em resposta à temperatura e as contribuições relativas de 14C02 e [14C] malato para a exportação de etiquetas foram diferentes nas duas plantas estudadas C A M (Kalancho6 daigremontiana, Sempervivum Montanum).Em outras experiências, foram estudados a resposta à temperatura dos padrões de rotulagem produzidos pela fixação 14CO2 e a luz e a escuridão.No tecido que acumulou malato (estado acidificado), um aumento da temperatura diminuiu as taxas de fixação de CO2 escuro, enquanto as taxas de fixação de CO2 na luz permaneceram amplamente não afetadas.Um aumento da temperatura mudou os padrões de rotulagem de um tipo C4 (sendo o malato o composto principalmente rotulado) para um tipo C3 (etiqueta em carboidratos).Essa mudança nos padrões de rotulagem pode ser observada no tecido que esgotou o malato armazenado anteriormente (estado desacidificado).Os resultados indicam que no tecido acidificado o aumento da temperatura aumenta o efluxo de malato do vacúolo alterando as propriedades do tonoplasto.Supõe-se que o aumento da exportação de ácido málico diminua a atividade in vitim da fosfoenol piruvato carboxilase por inibição do feedback.Abreviações. "CAM = metabolismo do ácido crassulaceano; peso fwfresh; pepcase-fosfoenolpiruvato carboxilase * dedicado ao professor O.L. Lange, Wfirzburg, por ocasião de seu 60º aniversário ** a quem a correspondência deve ser abordada
Palavras -chave: metabolismo do ácido crassulaceano - Kalanc H O 6 - fosfoenolpiruvato carboxilase - sempervivum - temperatura e c a m
Introdução está bem documentada na literatura que a temperatura influencia o metabolismo do ácido crassulaceano (CAM) de várias maneiras (para revisões, ver Kluge e Ting 1978; Osmond 1978; Winter 1985; Ting 1985).A temperatura afeta os processos C a M do período escuro, tanto quanto os do período de luz.A fixação líquida de CO2 e o acúmulo de ácido malic durante a noite são favorecidos por mais baixa e inibidos pela temperatura noturna mais alta (Queiroz 1965; Kluge 1968; Neales 1973; Kaplan et al. 1976; Meyer 1979; Medina e Osmond 1981).Verificou -se que a temperatura ideal para o processo noturno C A M estava entre 10 ~ e 20 ~ C na maioria das plantas estudadas até agora.Os processos C a M durante o dia, isto é, depleção de ácido málico e reafirmilação fotossintética do 0 2 derivado de ácido málico, também são influenciados pela temperatura: altas temperaturas favorecem esses processos, enquanto as temperaturas inferiores a 20 ~ C são acentuadamente inibidoras (consulte oliteratura mencionada acima).É improvável que a temperatura afete C a m por um único mecanismo geral.Em vez disso, vários efeitos de temperatura provavelmente mais ou menos independentes podem ser distinguidos.Por exemplo, em muitos casos, a temperatura atua em c a m indiretamente, influenciando o comportamento estomático por meio das diferenças de potencial da água entre a planta e o ar ambiente (Lange e Medina 1979; Osmond et al. 1979; Medina 1982; Von Willert et al. 1983;Friemert et al.A temperatura pode, por outro lado, também afetar diretamente os processos metabólicos do CAM.Um exemplo típico é a temperatura de-
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V. Friemert et al.: Efeitos de temperatura no efluxo de ácido malic em plantas de came
Tabela 1. Pré -tratamento das plantas antes dos experimentos.Par = série de radiação fotossinteticamente ativa de expts,
UM
B
Pré -cultivo em estufa (meses)
5-7
6-7
Precnltivation na duração da câmara de crescimento (semanas)
Regime leve
Regime de temperatura (~
Rel.umidade aérea (%)
1
12 h luz 20 w.m -2 par de lâmpadas fluorescentes
15 (escuridão)
40 (dia)
12 h escuridão
25 (luz)
70 (noite)
10 h luz 16 w.m - 2 par de lâmpadas HQL, 400 W;14 h escuridão
19 (escuridão)
30 (dia)
30 (luz)
60 (noite)
3
Pendência do equilíbrio entre respiração e acúmulo de ácido malic durante a noite (Kaplan et al. 1976; Wagner e Larcher 1981; Winter e Tenhunen 1982; Ritz et al. 1987).Finalmente, Wilkins (1983) foi concluído a partir de mudanças de fase relacionadas à temperatura dos ritmos endógenos de troca de CO2 mostrados por plantas de came que alterações de temperatura podem influenciar a permeabilidade do tonoplasto, controlando assim o transporte de ácido malic em toda essa membrana.A hipótese apresentada por Wilkins é interessante para entender os mecanismos que controlam o came, mas requer mais provas experimentais.Nosso presente estudo deve ser visto nesse contexto.Em primeiro lugar, nosso objetivo foi obter mais dados quantitativos sobre os efeitos da temperatura no efluxo de malato dos vacúolos das células da planta de came.Em segundo lugar, estávamos interessados em descobrir se as características do efluxo podem ou não estar correlacionadas com os efeitos da temperatura no padrão de marcação que ocorre durante a fixação 14CO2 na luz.Se a hipótese de Wilkins for válida, um aumento da temperatura deve mudar esses padrões de rotulagem de um tipo C4 (rótulo substancial preso em produtos da via carboxilase de piruvato de fosfoenol (Pepcase)) para uma via do tipo C3 (principalmente produtos da via fotossinéticasendo rotulado).Essa previsão é baseada no pressuposto de que um aumento da exportação de malato do vacúolo para o citoplasma aumentando a temperatura deve diminuir a atividade da pepcase pela inibição do feedback.Escolhemos nossos estudos fatias de tecido foliar de plantas de came suspensas em tampão isotônico.Este sistema foi introduzido por Kluge e Heininger (1973) na pesquisa de CAM e foi posteriormente estudado no contexto dos efeitos das condições de temperatura, pH e osmótico no transporte de ácidos malic em todo o tonoplast (Liittge e Ball 1974a, b; 1977;Lfittge et al.Vale a pena mencionar que as abordagens experimentais relatadas no
O presente artigo foi iniciado independentemente em dois laboratórios (universidades técnicas de Darmstadt e Munique, FRG).Devido às inter -relações estreitas do problema estudado, decidimos combinar os resultados em um único artigo.Essa história pode explicar certos desvios da maneira como as plantas foram pré -tratadas e algumas das experiências foram projetadas.Material e métodos Material vegetal.Clones das plantas obrigatórias de came kalancho6 Daigremontiana hamet et perr.e Sempervivum Montanum L. foram cultivados em estufas sob condições naturais de luz e temperatura.As plantas cresceram em vasos de barro com "solo padrão" hortícola.Quando usados, as plantas tinham cerca de seis meses de idade.Antes de iniciar um experimento, as plantas foram transferidas para aclimatação para um gabinete de crescimento.Os detalhes das condições de crescimento aplicados às plantas estão descritos na Tabela 1. Foi garantido pelas medições do analisador de gás infravermelho de acordo com Kluge e Fischer (1967) de que as plantas mostraram a troca líquida de CO2 típica para CAM (ver Kluge e Ting 1978Osmond 1978) quando usados nos experimentos.
Preparação de fatias de tecido foliar.As folhas totalmente expandidas foram colhidas das plantas no final da noite, quando haviam acumulado o ácido málico (estado "acidificado") ou no final do dia, quando o ácido málico armazenado foi esgotado ("desacidificado" no estado).Cerca de 1 g de material foliar foi rapidamente congelado e descongelado, e a seiva do teto foi espremida por uma prensa gariic.No SAP obtido, o potencial de água osmoticamente relacionado (~ u ~) foi determinado kryoscopicamente.De acordo com o ladrilho medido ~ u ~, um tampão isotônico ("meio de suspensão") foi preparado (n, n-bis (2-hidroxietil) glicina, 5 0 m m; caso, 0,1 mm; pH 7; sorbitol conforme necessário).A partir das lâminas de folhas maduras (sem ribmon), as fatias de tecido (1 mm de espessura) foram cortadas como descrito por Kluge e Heininger (1973) e imediatamente suspensas no tampão isotônico.O buffer foi mantido na temperatura necessária posteriormente no experimento e aerado vigorosamente transmitindo ar.Cerca de 20 g de tecido foram suspensos em 1 1 de tampão e lavados por cerca de 30 min, enquanto o buffer foi alterado repetidamente.Experimentos experimentais de efluxo de projeto (série A).O objetivo dos seguintes experimentos foi estudar os efeitos da temperatura em [14C] Malate Effiux
V. Friemert et al.: Efeitos de temperatura no efluxo de ácido malic em plantas de came a partir do tecido foliar prelabelado no meio de suspensão.Com as condições aplicadas e escalas de tempo dos experimentos, esse effiux representa principalmente o efluxo maleado dos vacúolos (Kluge e Heininger 1973).Como, nos experimentos de efluxo, um grande número de amostras teve que ser tratado, o método do traçador era mais conveniente do que a estimativa analítica do conteúdo de malato em extratos de tecido e meios de suspensão.Portanto, essas análises foram realizadas apenas com algumas amostras selecionadas.O procedimento experimental detalhado foi o seguinte: 1 g do tecido lavado acima mencionado (estado acidificado) foi suspenso em copos de 50 ml contendo 10 mL do meio de suspensão isotônica.As amostras foram agitadas suavemente em um banho de água realizado na escuridão à temperatura mostrada nas figuras relevantes.Após 10 chuva, foi adicionado Nah14Co3 (7.4.10 z kbq; atividade específica 2,22 gbq.mmo1-1) e as fatias de tecido foram autorizadas a incorporar ~ 4c na escuridão para 30 chuva.Esta fase dos experimentos é indicada como "pré -incubação" (compare as Figs. 1 e 2).Após a pré -incubação, o tecido marcado foi rapidamente separado do meio de incubação por filtração através de redes de nylon.O tecido marcado foi então lavado com meio de suspensão não radioativo e ressuspenso com meio de suspensão (10 ml.g -~ tecido) em frascos fechados de Erlenmeyer (50 ml).Os frascos foram conectados a frascos de lavagem contendo 10% de KOH e foram mantidos nas temperaturas desejadas (banho de água).Todas as manipulações foram realizadas em luz fraca o suficiente para excluir a possibilidade de que o tecido prelabelado tenha realizado fotossíntese enquanto era tratado.As amostras marcadas foram então incubadas por 1 h na escuridão, enquanto um fluxo permanente de ar foi passado primeiro através do meio de suspensão com as amostras e depois pela armadilha de Koh.Esta fase do experimento será indicada como "incubação".No final da incubação, o tecido foi separado do meio de incubação e imediatamente transferido para a ebulição a 70% de metanol.O meio de suspensão restante nos frascos de Erlenmeyer foi acidificado por ácido acético enquanto ainda estava conectado às armadilhas de K o H para recuperar o final do 14CO dissolvido.Alíquotas do KOH nas armadilhas foram então contadas para a radioatividade.Os valores encontrados representam a liberação do 14CO2 pelo tecido durante a incubação.Além disso, alíquotas do meio de suspensão (restantes da pré -incubação e incubação) foram contadas para a radioatividade.Os valores encontrados representam o efeito de compostos marcados no meio de suspensão durante a fase relevante do experimento.Como, nas condições descritas, praticamente apenas [14c] malato foi encontrado (não mostrado nas figuras), o ~ 4Cefflux no meio de suspensão é denotado no seguinte como "Effiux malato".Para obter a radioatividade restante no final da incubação no tecido, as amostras foram extraídas pela primeira vez por ebulindo 70% de metanol (10 min), seguidos de extrações com 40% de metanol e finalmente com água (10 min cada).Os extratos foram reunidos, levados para um volume final, e a radioatividade foi contada em alíquotas.A separação dos compostos marcados nos extratos por cromatografia em camada fina mostrou que entre 90 e 95% do rótulo de tecido estava em [*4c] malato (não mostrado nas figuras).[14C] o malato foi isolado dos extratos de tecido como do meio de incubação, e a distribuição do rótulo intramolecular nesse malato [~ 4C] foi estimado de acordo com Kluge et al.(1974).
Fixação de J4C02 na luz (série B).O objetivo dos experimentos a seguir foi estudar, com tecido foliar suspenso, efeitos de temperatura na distribuição do rótulo provocados pela fixação 14CO 2 na luz.A preparação e pré -tratamento das fatias de tecido eram os mesmos que já descritos para a série A. para cada
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Tratamento de temperatura, duas amostras paralelas foram iluminadas de cima pelas lâmpadas Argaphot B11 500-W (Philips, Eindhoyen, Holanda), fornecendo uma radiação fotossinteticamente ativa (PAR) de 56 W.M -2 No nível do tecido, enquanto duas amostras paralelas adicionais foram mantidas na escuridão (mas condições idênticas) envolvendo -as em papel alumínio.Após pré-incubação por 10 min, foi adicionado NaH14CO3 (7.4.102 kbq; atividade específica 2,22 gbq-mmol-1) a cada amostra e o tecido foi autorizado a corrigir 1 ~ CO 2.A incorporação 14CO 2 no tecido foi interrompida rapidamente decantando o meio de suspensão radioativo e substituindo -o por metanol fervente.As alíquotas do meio de suspensão foram acidificadas com ácido acético, secas e redissolvidas em volumes conhecidos de água.Em alíquotas dessas amostras, a radioatividade e o conteúdo de malato foram determinados.Os dados representam o eflnx do malato marcado com 14C do tecido para o meio de suspensão durante o tempo de incubação.O tecido rotulado foi extraído de acordo com o método de Kluge et al.(1973).A medição da radioatividade no extrato solúvel e no amido seguiu os procedimentos de B6cher e Kluge (1978).A distribuição de etiquetas entre produtos solúveis foi estudada por cromatografia bidimensional de camada fina como já descrito (B6cher e Kluge 1978).
Procedimentos analíticos.A radioatividade foi medida por meio de contagem de cintilação líquida.Os dados foram corrigidos para extinção.O Malato L foi medido enzimaticamente de acordo com Hohorst (1970).
Resultados
Efeitos de temperatura no efluxo de [14C] malato e ~ 4C02.Em uma primeira série de experimentos (série A), teve como objetivo estudar a inter -relação entre a temperatura e a exportação de malato do vacúolo.Como um indicador de tal exportação, usamos a liberação de radioatividade de fatias de tecido suspensas preloceladas pela fixação escura de CO2.Sob as condições experimentais dadas, o malato [14C] liberado dos vacúolos apareceu como malato [l*c] no meio de suspensão, ou foi descarboxilado, aparecendo fora na forma de 14Coz presos em frascos de koh.A Figura 1 (Kalanchoy Daigremontiana) e a Fig. 2 (Sempervivum Montanum) mostram que a temperatura durante a pré -incubação (ou seja, durante o tempo de aplicação de etiquetas), bem como a posterior (durante a incubação) influenciou a exportação de [14c] malato e também a liberaçãode 14CO2.As tendências gerais foram semelhantes nas duas plantas estudadas.Ou seja, a exportação de radioatividade durante a incubação aumentou quando a temperatura foi aumentada.A 35 ~ C, durante a incubação de 1 h, a maior parte da etiqueta incorporada anteriormente foi liberada do tecido.Os valores QLO do efluxo do rótulo não foram iguais em todas as faixas de temperatura estudadas até agora (Tabela 2).Os valores mais altos foram observados entre 15-25 ~, enquanto entre 5-15 ~ e 25-35 ~ C, o QLO foi claramente menor.
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V. Friemert et al.: Efeitos de temperatura no efluxo de ácido malic em plantas de came
1
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Fig. 1. Fatias de tecido de Kalanehoy Daigremontiana Prelabelada pela fixação 14CO2 na escuridão: Efeitos da temperatura aplicados durante a pré -incubação e incubação no efito de [14c] malato e l ~ zuz durante a incubação
Fig. 2. Fatias de tecido de sempervivum montanum prelabeladas pela fixação 14CO2 na escuridão: efeitos da temperatura aplicados durante a pré-incubação e incubação no efluxo de 14C-Malato e 14C0Z durante a incubação
A exportação de [14C] malato e 14C02 dependia também da temperatura aplicada durante a pré -incubação.Novamente, o efluxo aumentou com o aumento da temperatura.O fato de a temperatura durante a pré -incubação também ser importante é interessante, porque indica um tipo de efeito de memória.Como conseqüência das respostas de temperatura observadas, os maiores valores de exportação de etiquetas do tecido ocorreram quando as temperaturas durante a pré -incubação e durante a incubação foram altas,
enquanto os valores mais baixos foram observados quando a temperatura estava baixa durante a pré -incubação e a incubação.Houve diferenças entre as duas plantas estudadas nos valores da QLO (Tabela 2), na quantidade relativa de 14C liberados e na proporção relativa de ~ 4c02 e [~ '~ c] malato no efluxo (Figs. 1, 2).Sempervivum exibiu valores mais baixos de QLO da exportação de etiquetas (Tabela 2), uma contribuição proporcionalmente mais alta de ~ 4Co2 para a liberação total
V. Friemert et al.: Efeitos de temperatura no efluxo de ácido malic em plantas c a m
de etiqueta e uma liberação de etiqueta claramente mais alta na faixa de baixa temperatura (5-15 ~ c).Nos experimentos com Kalanchoo, nos vários regimes de temperatura, a distribuição intramolecular do rótulo foi determinada para o malato [14c] liberado no meio e para o restante no tecido.A distribuição do rótulo em malato a partir do meio de suspensão e do tecido era praticamente o mesmo (r = 0,041) e era independente da temperatura.Ou seja, cerca de 70% do rótulo foi localizado no átomo C4 do p4c] malato, cerca de 30% no átomo de CJ.Vale ressaltar que obtivemos respostas de Effiux semelhantes à temperatura quando, em vez do traçador, o conteúdo do malato foi considerado.Como, no entanto, como mencionado em materiais e métodos, o conteúdo de malato não foi estimado para todos os tratamentos mostrados nas Figs.I e 2 e, além disso, a estimativa do conteúdo de malato não forneceu informações adicionais, esses dados não foram incluídos neste artigo.Os seguintes valores podem, no entanto, mostrar as ordens de magnitudes de alterações no conteúdo de malato que ocorrem em algumas experiências de efluxo.Por exemplo, em K. DaigroMontiana, com pré -incubação a 15 ~ c, o conteúdo de malato no tecido diminuiu de inicialmente 165 gmol.g -um peso fresco (FW) para 110 p m l 'g 1fw durante 1 h de incubação a 35 ~ C.Essa diferença pode ser explicada pelo aparecimento de 21 pmol.g - t f w malato no efluxo, enquanto o malato de 46 pmol desapareceu de outra forma, provavelmente por descarboxilação.Em um experimento idêntico com S. montanum, o teor de malato diminuiu de inicialmente 30 p m o l - g - ~ f w a 9,7 g m o l.G - 1 FW, com 4,4 gmol aparecendo no efluxo e cerca de 16 gmol desaparecendo por descarboxilação.
Padrões de ~ 4 c - l a b e l i n g de luz e escuridão.A Figura 3 mostra as respostas de temperatura da fixação do T'Co2 na luz e na escuridão.Houve uma grande diferença no comportamento de tecidos acidificados e desacidificados.No tecido acidificado, a fixação de A'Co2 na luz estava em cada temperatura pelo menos dez vezes maior que na escuridão.A resposta à temperatura da fixação da luz 14CO2 mostrou um ótimo ótimo entre 20 ~ e 35 ~ C, mas mesmo a 40 ~ C a incorporação 14CO2 ainda era alta.A fixação 4CO2 escura no tecido acidificado diminuiu acentuadamente com o aumento da temperatura.Ou seja, mesmo com temperaturas superiores a 20 ~ apenas traços de etiqueta foram incorporados.No tecido desacidificado, as taxas de fixação T4CO2 na luz e na escuridão eram, na faixa de temperatura mais baixa, quase idênticas.U p a 20 ~ c as duas taxas aumentaram, mas a temperaturas mais altas CO2
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Tabela 2. Valores qT0 do total [*4C] malato, 14C02 e etiqueta total e fluxo de fatias de tecido de K. daigremontiana e S. Montanum durante a incubação.Os dados derivam das experiências mostradas nas Figs.1 e 2 effiux
Varia de temperatura durante a incubação 5-15 ~ c
K. DAIGREMONTIAN: [T4C] Malate 2.1 14CO2 2 Total 2 S. Montanum: [14c] Malato
1.3
14C02
1
Total
1.1
15-25 ~ c
25-35 ~ c
2,8 2,5 2.8
1.5 2,0 1.9
T.5 2.8 2.1
1.5 1.2 1.5
10
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